Рыба-сенсор

Первая работа в этом направлении у российских биологов вышла осенью прошлого года. Тогда они вместе с коллегами из научной группы профессора Игоря Меглинского (Университет Оулу, Финляндия) предложили использовать в качестве имплантируемого сенсора капсулы с начинкой из pH-чувствительного флуоресцирующего красителя SNARF-1, у которого с изменением кислотности меняется спектр флуоресценции. Оболочка капсулы состоит из нескольких слоев полимеров и выполняет две функции: улучшает биосовместимости системы и не выпускает большие молекулы SNARF-1 наружу (при этом различные низкомолекулярные вещества могут проходить через эту пористую оболочку, поэтому pH внутри капсулы оказывается таким же, как и снаружи). Локализация красителя очень важна — иначе SNARF-1 растекался бы по всему объему жидкости, к которой его добавляют, и для получения сигнала флуоресценции нужной интенсивности в животных приходилось бы вводить так много красителя, что это уже было бы опасно для их жизни. Ученые показали, что такая система хорошо подходит для мониторинга pH у одного из видов байкальских эндемиков — рачков-амфипод или бокоплавов. А одновременно с этим исследованием ученые вместе с научного группой Антона Садового из Национального института материаловедения и инженерии (Сингапур) вели исследования на более универсальных подопытных организмах — рыбках данио-рерио, или, как их еще называют, рыбах-зебрах. Кислотность крови — важный физиологический показатель для многих организмов. Например, у рыб в нормальном состоянии pH колеблется в районе 7,7 — 7,8, а изменение кислотности говорит о серьезных проблемах. Например, при гипоксии (недостатке кислорода) в крови накапливается углекислый газ и кислые продукты анаэробного метаболизма, что приводит к понижению pH. «Мы хотим предложить мировому научному сообществу эффективную методику для прижизненной оценки стресс-ответа организма, которая будет доступна любому исследователю в любой части планеты, — рассказывает Тимофеев. — Проще всего это сделать на знакомых всем объектам и поэтому в новом исследовании мы переключились на рыбок данио-рерио, классический лабораторный объект, широко применяемый в научных исследованиях: не так много найдется желающих осваивать новый метод, если он изначально „заточен“ только под применение на уникальных байкальских эндемиках». В своей работе ученые использовали капсулы с флуоресцентным красителем размером около 5 микрон и под анестезией (суспензией гвоздичного масла) вводили их в почки данио-рерио. Дальше эти сенсорные микрочастицы попадали в кровоток и разносились по всему телу. В эксперименте измеряли pH в капиллярах жабр рыбы. Для этого данио-рерио вылавливали, удаляли у них жаберные крышки (данио-рерио без жаберных крышек продолжают жить) и после этого помещали под флуоресцентный микроскоп. Он фокусировался на отдельные капилляры с микрокапсулами красителя внутри, снимал спектры флуоресценции и после этого переводил их в значения кислотности (до начала эксперимента сенсоры калибровали в разных физиологических средах — соляном растворе, плазме крови карпа, а также крови рыбки-зебры, чтобы однозначно сопоставить характерные изменения флуоресценции и pH). Похожим образом кислотность также измеряли в межклеточном пространстве мышц около спинного плавника. Такую методику пока сложно назвать безболезненной и незаметной для рыб, но до этого все было гораздо хуже: для того чтобы узнать pH подопытных рыб их нужно было умертвить. «Конечно, подопытных животных в наших экспериментах было жалко, но иначе пока не получается и наш метод уже сделал большой шаг вперед по сравнению с другим процедурами изучения физиологических показателя рыб или других небольших животных, — рассказывает Тимофеев. — Сейчас, например, чтобы измерить pH данио-рерио, у нее необходимо отобрать почти всю кровь и тем неминуемо умертвить. Соответственно, если вам нужно посмотреть динамику воздействия какого-то фактора в течении несколько дней или недель, то придется каждые сколько-то дней умерщвлять новую группу рыб. С имплантируемыми же сенсорами можно регулярно измерять физиологические параметры одного и того же организма, и тем не только снижать необходимое количество особей, но еще и оставлять их живыми в ходе исследования». Исследование показало, что имплантируемые сенсоры позволяют надежно отслеживать изменения кислотности: в нормальном состоянии данио-рерио сенсоры фиксировали pH в районе 7,3 — 7,5 (такие сравнительно небольшие отклонения от среднего 7,7 — 7,8 — это норма для рыб-зебр), а если подопытные рыбки впадали в кому или умирали (ученые не провоцировали состояние комы или смерти специальным образом — некоторые индивиды самопроизвольно в него впадали из-за стресса, связанного с анестезией и при вводе сенсорных капсул), то это сопровождалось характерным закислением pH до значений около 6,8 — 7,0. Так ученые показали, что новый метод чувствителен к критическим изменениям в состоянии рыбы вроде наступления комы или смерти, а в будущем они планируют развить свой подход и сделать инкапсулированные флуоресцентные сенсоры гораздо более чувствительными. Точность работы сенсоров также проверили классическими методами: для этого некоторых подопытных рыб умерщвляли и определяли кислотность их крови с помощью pH-чувствительных микроэлектродов. Значения кислотности, измеренные в жаберных капиллярах с хорошей точностью совпали с этими результатами за исключением небольшого смещения в область повышенных pH, которое по мнению ученых может свидетельствовать не о слабостях нового подхода, а о несовершенстве классических методов, при котором анализируемые физиологические жидкости в контакте с воздухом могут незначительно закисляться (то есть обладать чуть меньшим pH). «Одна из основных целей нашего проекта — это разработка новых методов для экологического мониторинга состояния озера Байкал, — рассказывает Тимофеев. Чувствительность байкальских эндемиков гораздо выше, чем у обитателей обычного пресного водоема — то есть те уровни загрязнения, которые для других организмов считаются нормальными, у байкальских эндемиков часто вызывают серьезные негативные изменения. Поэтому традиционные сертифицированные методики экологической оценки — например по выживаемости маленьких ракообразных, дафний — на Байкале могут давать ошибочное понимание. Они должны быть адаптированы под специфику эндемичных организмов. Имплантируемые оптические сенсоры помогут справиться с этой задачей: по мере развития технологий с их использованием можно будет вести непрерывный скрининг стрессового состояния одного и того же тест-объекта и точно отслеживать эти процессы in vivo, то есть прижизненно — без изъятия организма из среды и тем более без его умерщвления». Кроме экологического мониторинга новую разработку можно использовать и в других областях. Имплантируемые сенсоры, по словам ученых, можно применять в различных биомедицинских решениях, например для непрерывного мониторинга стрессовых состояний у спортсменов, работников вредных производств или в агроиндустрии, для создания «умных ферм» — роботизированных сельскохозяйственных комплексов, состояние растений в которых которых будет постоянно отслеживаться с помощью различных вживленных в них сенсоров. Пока исследователи отрабатывают свою технологию. Они хотят адаптировать флуоресцентные сенсоры к различным живым организмам (насекомым, моллюскам, а в перспективе — даже млекопитающим), а также тестируют сенсоры для определения других физиологических параметров и оценки концентрации в телах эндемиков различных промышленных загрязнителей вроде тяжелых металлов.