Да будет свет: как светящиеся конструкции помогают изучать физику биомолекул

Оптические методы являются одними из основных способов исследования биологических объектов. Корреспондент портала InScience.news пообщался с сотрудниками лаборатории физико-химии биомембран биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, которые исследуют физические механизмы на уровне молекул с помощью светящихся конструкций. Среди проектов коллектива — исследование систем направленной доставки антиоксидантов, синтез наночастиц для фотодинамической терапии рака, а также разработка метаболических сенсоров для органоидов клетки.Евгений Максимов, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией: Здание, где мы находимся, называется лабораторией искусственного климата. Изначально его использовали для исследований того, с чем могут столкнуться люди в космосе. В 70-х годах прошлого века акцент сместился в сторону Земли — на изучение «зеленых» объектов. Сейчас здесь расположена кафедра биофизики биологического факультета МГУ. Наша группа активно работает с различными белками: от синтеза до изучения их функций. У нас это хорошо получается, конечно, за счет взаимодействия с коллегами, как российскими, так и зарубежными. Благодаря этому мы стали выигрывать гранты и модернизировать приборную базу.— Какое у вас есть оборудование?Е. М.: Сейчас у нас более-менее хороший набор оптических методов — можно даже сказать, уникальный. Недавно появился мультифотонный микроскоп, который мы сами собрали и сейчас продолжаем модернизировать. Возбуждение молекул в нем происходит за счет поглощения нескольких квантов света, что позволяет воздействовать на довольно глубокие слои образца. Мы детектируем отдельные фотоны и то, как они распределены во времени и пространстве. В итоге мы получаем своего рода «кино», как живой объект реагирует на вспышку света. Эту вспышку мы можем сделать очень короткой, порядка миллиардной доли секунды, благодаря фемтосекундному лазеру. Светящиеся молекулы возбуждаются и затем релаксируют, то есть возвращаются в исходное энергетическое состояние, испуская свет. Разные красители и в разном окружении ведут себя иначе: в одном месте затухание будет происходить быстрее — различается время жизни возбуждения. Это может быть полезно, когда два соединения светятся в одном диапазоне, так как это помогает различить их сигналы.Самое интересное, что можно делать на нашем микроскопе — исследовать взаимодействие окрашенных молекул, способных делиться энергией, когда они находятся близко друг от друга. Донор передает возбуждение акцептору, и тот испускает свет, а флуоресценция донора тушится. Так можно пометить две молекулы или их фрагменты и наблюдать, как они взаимодействуют друг с другом.— По каким направлениям идет сейчас работа?Е. М.: У нас несколько областей научной деятельности, но все они так или иначе связаны с исследованием процессов и объектов, которые порой не видны даже в микроскоп. Речь идет о конформационных изменениях, то есть перемещении фрагментов молекулы, внутриклеточных реакциях, переносах энергии и многом другом. Необходимо разрабатывать подходы, основанные на неких функциональных характеристиках, и в этом нам во многом помогает наше оборудование и активное взаимодействие с коллегами из других организаций. Например, одно из направлений — исследование встраивания каротиноидов в клеточные мембраны и оценка того, как это влияет на свойства последних.Алексей Семенов, кандидат биологических наук, инженер: Каротиноиды защищают клетки от повреждения со стороны свободных радикалов при окислительном стрессе. При многих патологических процессах (например, авитаминозах, лучевом поражении, вследствие негативных экологических факторов, в процессе старения и при других состояниях) эффективность антиоксидантного действия в организме человека может снизиться, и потому бывает необходима медикаментозная доставка антиоксидантов.Однако существует проблема: такие вещества плохо усваиваются в организме. В свободной форме каротиноиды либо идут в печень и там накапливаются, что может вызвать серьезные проблемы со здоровьем, либо разрушаются, и их эффективность значительно уменьшается. Потому мы ищем способы, как, с одной стороны, повысить биодоступность каротиноидов, и с другой — сохранить антиоксидантное действие.Как это часто бывает, природа все уже давно придумала за нас. Цианобактерии, например, синтезируют особые белковые конструкции, которые способны эффективно осуществлять перенос каротиноидов. Белковая оболочка позволяет растворять каротиноиды в водной среде и тем самым повышает их усвояемость. Это приводит к высокой эффективности антиоксидантного воздействия, что обеспечивает надежную защиту от фотоповреждения при осуществлении бактерией фотосинтеза. Сегодня наша задача как ученых заключается в адаптации таких белков-переносчиков для направленной доставки каротиноидов в клетки организма человека.— Применяете ли вы лазерно-оптические методы?А. С.: Да, и в качестве модельных мембранных объектов мы используем взвесь липосом — сфер, составленных из одного или нескольких липидных слоев, сходных по строению с мембраной клетки. Цель наших экспериментов заключается в оценке изменений свойств мембран при доставке каротиноидов. Для этого липосомы помечены светящимся красителем, характеристики флуоресценции которого сильно зависят от окружения. Так, по кинетике затухания его флуоресценции мы можем получить информацию о свойствах липосом — например, оценить вязкость мембраны, что является характеристикой встраивания каротиноидов в нее. Мы полагаем, что в будущем такие знания позволят разработать систему оценки эффективности адресной доставки антиоксидантов и существенно расширить возможности подхода в целом. — Как этот подход используется в медицине?Е. М.: Применение биодоступных антиоксидантов очень перспективно при фотодинамической терапии рака. При этом в опухоль доставляется фотосенсибилизатор, который под действием света запускает каскад радикальных реакций, и за счет них происходит гибель окружающих клеток. Но нам важно защитить здоровые ткани — в этом помогут системы доставки антиоксидантов. Даниил Гвоздев, кандидат биологических наук, научный сотрудник: Мы разрабатываем в том числе и комплексные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии. Все началось с любопытного направления, которое касалось использования реакционных центров фотосинтетического аппарата некоторых организмов в качестве компонента солнечных батарей. Напомню, что в реакционном центре при поглощении кванта света происходит разделение зарядов, с которого, по сути, и начинается электрический ток. Но дело в том, что без помощи природного светособирающего комплекса работа такого генератора крайне неэффективна — можно светить очень ярким светом, а ток на выходе окажется мал. Искусственный аналог светособирающего комплекса был найден быстро — полупроводниковые квантовые точки. Они отлично поглощают свет в широком диапазоне длин волн и очень ярко флуоресцируют, а значит, способны передавать энергию в реакционный центр.Сам принцип оказался применим и в фотодинамической терапии. Поглощательная способность современных фотосенсибилизаторов все еще далека от идеальной, и дополнительные источники энергии могут быть полезны. Собственно, я в своей научной деятельности пытаюсь оценить перспективы использования люминесцентных частиц для этих целей. Сами по себе фотосенсибилизаторы имеют узкую полосу поглощения в красной области спектра. Можно собирать дополнительную энергию в видимой области длин волн — это сработает в случае поверхностных опухолей. Можно собирать свет в ближней инфракрасной области, используя эффект апконверсии. Это будет полезно для работы с опухолями глубокого залегания, так как инфракрасный свет лучше проникает в биологические ткани.Спектр доступных люминесцентных наночастиц (впрочем, как и фотосенсибилизаторов) очень широк. Их гибридные комплексы являются очень сложной системой с внушительным количеством степеней свободы. За прошедшие восемь лет мы проделали большую работу по углублению и систематизации имеющихся данных в этой области. При определенных условиях и комбинациях компонентов удалось многократно усилить способность фотосенсибилизатора генерировать активные формы кислорода. Думаю, лучшие комбинации еще ждут своего открытия.— А какими комбинациями вы пользуетесь сейчас?Д. Г.: На первом этапе мы использовали полупроводниковые нанокристаллы с ядром из селенида кадмия, однако совершенно очевидно, что наночастицы этого типа не будут актуальны в медицине: тяжелые металлы обладают неспецифической цитотоксичностью, то есть губят все клетки подряд. Сейчас мы работаем с ними исключительно как с модельным объектом. В прошлом году перешли на синтез углеродных люминесцентных наночастиц. Объект малоизученный, достаточно капризный, но мы уже достигли определенного прогресса в этом направлении.После того, как мы получили конструкцию, она должна попасть в нужную клетку и убить ее. Недавно мы осуществили доставку на основе белка трансферрина: в нашем организме он переносит ион железа из плазмы крови в клетку. Подобные исследования требуют тонкой технологии модификации поверхности наночастиц. Также нужен набор методов, позволяющих визуализировать гибридные комплексы внутри клетки, изучить особенности их внедрения и связанные с этим вещи. Все необходимое у нас в лаборатории имеется.Е. М.: У нас также есть класс задач по исследованию фотоактивных белков и фотоактивных конструкций, которые могут быть использованы для оптогенетики. Оптогенетика в общем понимании связывается с регуляцией активности нервных клеток, а именно с проводимостью ионных токов с помощью канальных белков, которые запускаются светом. Вместе с тем достаточно вопросов обусловлено не только электрической проводимостью, но и возможностью уметь включать и выключать определенные процессы в клетке с помощью света. Для этих задач нужна оптогенетика другого уровня, для которого необходимы водорастворимые фотоактивные белки — такие конструкции мы как раз исследуем. Суть в том, что под действием света структура этих белков сильно меняется — мы пытаемся изучить и сами изменения, и скорость, с которой они происходят.Елена Протасова, студент, инженер: Работа с водорастворимыми белками особенно внутри клетки имеет свои трудности. Внутриклеточные процессы могут сильно влиять на их состояние, поэтому необходимо уметь определять условия в цитоплазме и в разных компартментах. Я занимаюсь метаболическим биоимиджингом, то есть визуализацией состояния клетки или какого-то конкретного органоида по флуоресценции белков. Например, соединив белок-переносчик каротиноида с светящимся протеином, можно оценить, насколько эффективно клетка использует антиоксидант для защиты от активных форм кислорода — нормальных продуктов жизнедеятельности, но при нарушениях способных быть опасными.Кроме того, сейчас у нас есть совместный проект с лабораторией генетически кодируемых молекулярных инструментов Института биоорганической химии — это один из ведущих коллективов в мире, занимающийся изучением флуоресцентных белков. Вместе с ними мы сейчас испытываем внутриклеточные сенсоры, позволяющие определять кислотность. Также в нашей лаборатории была разработана методика измерения температуры на основе оптических свойств флуоресцентных белков. Выяснилось, что температура в разных органоидах варьируется: например, митохондрии «горячее» на пару градусов, чем остальные части клетки. Температура здесь рассматривается не в привычном для нас ключе, она скорее отражает метаболическую активность. Используя всего один флуоресцентный белок и присоединив к нему последовательности аминокислот, по которым он будет отправлен в ту или иную органеллу, можно по разнице во времени затухания флуоресценции определить ее функциональное состояние. Интересно, что сенсор реагирует только на температуру — в физиологических пределах на него не влияют ни кислотность, ни ионный состав.— Каковы ваши планы? Собираетесь ли ближайшее время пробовать свои молекулярные разработки на клетках или животных?Е. М.: У нас большие планы на эксперименты по доставке каротиноидов в клетки человека, однако проведение экспериментов на животных клетках — задача не простая. В своей работе мы в основном делаем упор на изучение процессов на молекулярном уровне: для нас важно именно понимание фундаментальных основ. Мы комбинируем различные подходы, чтобы результаты получались более полные и наглядные. Сейчас с нашим оборудованием мы имеем возможность исследовать явления не только в статике, но и в динамике, причем в обозримом будущем хотим собрать устройства с еще большим временным разрешением. Это поможет нам подробнее изучить процесс фотоактивации фотозащитных белков цианобактерий и начать использовать их в оптогенетике для практического применения. Работа с такими белками — очень сложная задача с высокими требованиями к объекту, методу получения и обработки данных, и нам не обойтись без установок класса «Megascience». Сейчас мы пишем заявки на проведение эксперимента на европейском рентгеновском лазере на свободных электронах (European XFEL), который предоставляет возможность определить структуру белка в динамике со сверхвысоким временным разрешением. Надеемся, что сможем с помощью этой уникальной установки изучить наши белки.