Биологи научились считать некодирующие РНК поклеточно
Некодирующими называют молекулы РНК, которые не выступают матрицей для синтеза белков. К некодирующим относят, например, транспортные (тРНК), малые ядерные (мяРНК) и другие. Наиболее известными являются микроРНК — короткие последовательности, обнаруженные у растений, животных и некоторых вирусов. Известно, что микроРНК участвуют в подавлении активности генов и, возможно, метилировании ДНК. Но точные функции этой и других некодирующих РНК остаются неизвестными. При этом методов для их изолированного изучения не существует: сейчас анализ коротких РНК проводится по целым комплексам клеток. Для восполнения этого пробела ученые из Каролинского института разработали метод глубокого анализа РНК по транскриптам. Они создали библиотеки адаптеров (двуцепочечных олигонуклеотидов с «тупым» и «липким» концами) для всех видов РНК, которые несут 5’-фосфатную и 3’-гидроксильную группы. 5’-концы адаптеров при этом помечались уникальными молекулярными идентификаторами (UMI) — для устранения ошибок полимеразной цепной реакции (ПЦР) и подсчета молекул. Затем с помощью утилит для чтения UMI (размещены на GitHub) авторы отфильтровывали последовательности по критерию длины (менее и более 40 нуклеотидов). Количество микроРНК, токсических РНК и пре-малых ядерных РНК в разных клетках (ось абсцисс — число нуклеотидов). / © Omid R Faridani, Nature Biotechnology, 2016 Молекулы сопоставлялись с базами данных по показателю экспрессии и разделялись на микроРНК, токсические малые РНК, мяРНК и отдельно — на первичные транскрипты мРНК (около 30 нуклеотидов) и длинные некодирующие РНК (более 200 нуклеотидов). После этого путем взвешивания последовательностей авторы определяли те, которые кодировались генами из разных локусов генома, и разрушали их. Метод тестировался на эмбриональных стволовых клетках и культуре клеток эмбриональной линии почки человека (HEK293FT). С его помощью ученые подсчитали, что в среднем в каждой клетке содержится 3,8 тысячи микроРНК, 3,5 тысячи токсических малых РНК и 600 мяРНК. Средняя длина микроРНК составила 22 нуклеотида, тРНК — 19 и 33 нуклеотида, мяРНК — 29 и 38 нуклеотидов. Сравнение зрелых молекул и их предшественников показало, что в зрелые микроРНК импортированы две шпильки пре-микроРНК, токсические малые РНК состоят из двух участков зрелой тРНК. «Это фундаментальное исследование и вместе с тем — демонстрация метода, который может использоваться в дальнейшем. Возможность сопоставить уровни коротких последовательностей РНК в одной клетке может помочь в уточнении функций этих последовательностей», — сообщил соавтор работы Омид Фаридани (Omid Faridani).
